ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ФУКОИДАНОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

  О.С. Вищук1, С.П. Ермакова2, Фам Дюк Тин3, Н.М. Шевченко2, Буи Минг Ли3, Т.Н. Звягинцева2

1 Дальневосточный государственный университет (690950 г. Владивосток, ул. Октябрьская, 27), 2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Россия (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159), 3 Нячангский институт технологических исследований и применений ВАНТ (Вьетнам г. Нячанг, ул. Хунгвонг, 02)

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ФУКОИДАНОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

Ключевые слова: фукоиданы, бурые водоросли, противоопухолевая активность.

Противоопухолевое действие фукоиданов из 9 видов бурых водорослей исследовано на модели мягких агаров. Показано, что фукоиданы нетоксичны к клеткам DLD-1 и HT-29 в концентрациях до 200 мкг/мл. Установлено, что фукоидан из Laminaria cichorioides, состоящий из 1,3-связанных молекул a-L-фукозы, ингибирует рост колоний раковых клеток кишечника, а низкосульфатированные фукогалактаны из Sargassum swartzii, S. mcClurei, S. denticarpum практически не обладают противоопухолевой активностью. Полученные результаты демонстрируют, что использование фукоиданов бурых водорослей дальневосточных морей может оказаться перспективным для предотвращения и лечения онкологических заболеваний.

В настоящее время большое внимание уделяется изучению полисахаридов, выделенных из таких природных источников, как бактерии, грибы, водоросли и растения. Полисахариды бурых водорослей представлены альгиновыми кислотами, ламинара- нами и фукоиданами, проявляющими различную биологическую активность. Так, альгинат натрия является самым активным и безвредным природным сорбентом, а также повышает фагоцитарную активность клеток животных и человека [10]. Лами- нараны (1,3- и 1,6-р^-глюканы) известны как противораковые вещества, радио- и криопротекторы, активаторы иммунной системы. Фукоиданы проявляют чрезвычайно широкий спектр биологической активности, что является причиной повышенного интереса к ним. Так, в литературе имеются сообщения о противоопухолевых и противовоспалительных свойствах фукоиданов. Особый интерес вызывает антикоагулянтное действие фукоиданов. Кроме того, эти соединения, как правило, являются иммуностимуляторами. По этой причине их можно отнести к так называемым «поливалентным биомодуляторам». Однако интенсивность изучения биологической активности фукоиданов значительно опережает исследования их химической структуры.

Имеется небольшое количество данных о связи структуры и биологической активности этих полисахаридов. Считается, что биологическая активность фукоиданов обусловлена в первую очередь степенью сульфатирования, наличием фрагментов определенной структуры. Кроме того, она может быть связана с моносахаридным составом, степенью разветвленности, типом связи, молекулярно-массовым распределением. С определенной уверенностью установить структурный мотив, который отвечает за проявление той или иной биологической активности фукоиданов, пока так и не удалось.

Целью настоящей работы явился анализ противоопухолевой и антиметастатической активности фукоиданов, выделенных из различных бурых водорослей и имеющих разную структуру, на модели мягких агаров.

Материалы и методы. Реагенты и материалы:

Водоросли: бурая водоросль Fucus evanescens была собрана в экспедиции НИС «Академик Опарин» в июле 2003 г. на побережье острова Большой Шантар Охотского моря; Laminaria japonica, Undaria pinatifida, L. cichorioides были собраны в июле 2005 г. в бухте Троица Японского моря на Морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО РАН; Sargassum sp. были собраны в Южно-Китайском море у побережья Вьетнама в мае-июне 2007 г. Полисахариды: фукоиданы были выделены по модифицированному методу .

Определение содержания общих углеводов в выделенных образцах полисахаридов проводили колориметрически с помощью феноло-сернокислотного метода. Определение содержания сульфатных групп в полисахаридах проводили с помощью титриметрического метода [7]. Кислотный гидролиз полисахаридов: образец фукоидана (5 мг) растворяли в 0,5 мл 2M трифторуксусной кислоты; реакционную смесь нагревали при 100°C в течение 6 часов. Моносахаридный состав определяли на углеводном анализаторе Biotronik IC-5000 (Германия), используя колонку Shim-pack ISA-07/S2504 (0,4x25 см); элюировали калиево-боратным буфером, скорость элюции - 0,6 мл/мин; обнаружение проводили бицинхонинатным методом; интегрирующая система Shimadzu C-R2 AX.

I3C-ЯМР-спектроскопия: спектры 13С-ЯМР для растворов веществ в D2O были получены на ядерномагнитно-резонансном спектрометре Bruker Avance DPX-300 NMR с рабочей частотой 75,5 МГц при температуре 60°C.

Культивирование клеток: клетки рака кишечника человека HT-29 и DLD-1 культивировали в питательной среде RPMI-1640, 10% FBS с добавлением пенициллина (100 Ед/л) и стрептомицина (100 мкг/л) в инкубаторе MCO-18AIC, SANYO (Япония) при температуре 37°С, содержание СО2 — 5%.

Определение цитотоксичности фукоиданов. Клетки рака кишечника человека HT-29 и DLD-1 (5х104/мл) рассевали в 96-луночные планшеты и культивировали в 200 мкл 10% RPMI-1640 в С02-инкубаторе при температуре 37°С в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали фукоиданами различной концентрации (10, 50, 100 и 200 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 часов. После инкубации добавляли по 15 мкл 3-(4,5 -диметилтиазол-2 -ил)-2,5 -дифенилтетразолин бромида (MTS-реагент) и инкубировали 4 часа (37°С, 5% CO2). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Bio-Tek Instruments (США), при длине волны 490/630 нм (А490/630).

Неопластическая трансформация клеток (метод мягких агаров). Действие фукоиданов бурых водорослей на формирование и рост колоний клеток рака кишечника человека определяли с помощью метода мягкого агара. Клетки рака кишечника (8х103 клеток) обрабатывали фукоиданами из бурых водорослей L. cichorioides, F. evanescens, U. pinnatifida, L. japonica, Sargassum swartzii, S. oligocystum, S. denticarpum, S. mcClurei, S. polycystum. (50, 100 мкг/мл). Клетки культивировали при 37°С (5% СО2) в течение 30 дней. Колонии клеток были оценены с использованием обратимого микроскопа Motic AE 20 (Китай) и программы Motic Image Plus.

Статистическая обработка данных проведена с использованием t-критерия Стьюдента в условиях заданной доверительной вероятности, равной 95% (программа SigmaPlot 2000, вер. 6, SPSS Inc., США).

Результаты исследования. Фукоиданы бурых водорослей были очищены при помощи описанной выше комбинации методов. Фукоиданы, выделенные из бурых водорослей дальневосточных морей, являются высокосульфатированными полисахаридами, тогда как фукоиданы из бурых водорослей Южно-Китайского моря — низкосульфатированные, за исключением фукоидана из S. polycystum. Содержание сульфатов в фукоиданах из L. cichorioides и U. pinnatifida составляет 38 и 36% соответственно. Фукоиданы из F. evanescens, L. japonica и S. polycystum содержат около 30% сульфатов. В остальных полисахаридах из саргассовых водорослей содержание сульфатных групп составляет менее 12%.

Анализ моносахаридного состава исследуемых соединений позволяет разделить их на фуканы, фу- когалактаны и галактофуканы. Фуканами являются сульфатированные полисахариды из F. evanescens, L. cichorioides. Фукогалактан выделен из L. japonica, галактофукан — из U. pinnatifida. Все полисахариды из саргассовых водорослей являются фукогалактанами (табл.).

По структуре главной цепи фукоиданы разделялись на три группы:

  1. Полисахариды, молекулы которых содержат в главной цепи 1,3-связанные a-L-фукопиранозные остатки (L. cichorioides);
  2. Полисахариды, молекулы которых построены из чередующихся 1,3- и 1,4-связанных остатков a-L-фу- копиранозы (F. evanescens);
  3. Полисахариды, в главной цепи которых чередуются 1,3-; 1,4-связанные остатки a-L-фукопиранозы

 

Обработка клеток DLD-1 и HT-29 фукоиданом из L. cichorioides в концентрации до 200 мкг/мл не приводила к торможению их роста и не сопровождалась массовой гибелью (рис. 1). Аналогичные результаты получены при использовании и других фукоиданов. В дальнейших экспериментах все препараты фукоиданов использовали в дозе 50 мкг/мл.


и галактозы (U. pinnatifida, S. swartzii, S. oligocystum, S. denticarpum, S. mcClurei, S. polycystum).

 

Торможение роста колоний в клетках DLD-1, обработанных фукоиданом в дозе 50 мкг/мл, составило более 50% для фукоиданов, выделенных из L. cichorioides, L. japonica. Фукоиданы из F. evanescens, U. pinnatifida, S. polycystum и S. oligocystum ингибировали рост колоний от 50 до 70%. Слабое ингибирование до 20% показали фукоиданы из S. swartzii, S. mcClurei, S. denticarpum (рис. 2, а).

Наиболее значительные показатели торможения роста колоний для клеточной линии НТ-29 были получены при обработке их фукоиданами из L. cichorioides и S. polycystum: в 2 раза по сравнению с контролем. Слабое ингибирование роста колоний фу- коиданами из S. swartzii, S. mcClurei, S. denticarpum было аналогично их действию на клетки DLD-1. Обработка фукоиданами из S. oligocystum, F. evanescens, U. pinnatifida и L. japonica клеточной линии НТ-29 приводила к снижению количества колоний от 60 до 70% (рис. 2, б). Сопоставление противоопухолевой активности 9 исследованных фукоиданов, собранных в разных регионах, позволило выявить среди них как высокоактивные ингибиторы роста колоний клеток рака кишечника, так и фукоиданы, практически не проявляющие противоопухолевого действия.

Обсуждение полученных данных. Различия в противоопухолевой активности между фукоиданами из различных источников обусловлены, по-видимому, особенностями их структуры. Исследуемые соединения отличаются друг от друга по типу гликозидных связей, моносахаридному составу, степени сульфатирования, молекулярной массе. Ранее на клеточной линии JB6 C141 нами было показано, что фукоиданы из L. cichorioides и L. gurianovae обладают более сильным ингибированием процесса трансформации клеток мыши JB6 C141 под действием эпидермального фактора роста по сравнению с фукоиданом из F. evanescens. Возможно, для проявления превентивного действия фукоиданов необходимо присутствие 1,3-связанной a-L-фукозы. В настоящем исследовании фукоиданы из L. ci- chorioides и L. japonica проявили наиболее выраженное противоопухолевое действие. Другие соединения, такие как фукоиданы из S. swartzii, S. denticarpum и S. mcClurei, практически не обладали противоопухолевой активностью.

Вероятно, противоопухолевая активность фукоиданов зависела от строения главной цепи молекулы. Об этом говорит тот факт, что фукоидан из L. cichorioides, проявивший наибольшую активность, содержал главную цепь, построенную только из а-1,3-связанной фукозы. Фукоиданы из F. evanescens и U. pinnatifida, активность которых была меньше, построены из 1,3- и 1,4-связанных остатков a-L-фукопиранозы и чередующихся 1,3- и 1,4-связан- ных остатков a-L-фукопиранозы и галактозы соответственно.

Таким образом, все исследованные полисахариды были нетоксичны в концентрации до 200 мкг/мл. В наших экспериментах на модели мягких агаров впервые показано, что фукоиданы из F. evanescens, L. japonica, L. cichorioides, U. pinnatifida, S. oligocystum и S. polycystum обладают противоопухолевой активностью по отношению к клеткам рака кишечника человека DLD-1 и HT-29.

Полученные данные могут представлять несомненный интерес, поскольку соединения, обладающие низкой токсичностью и проявляющие биологическую активность, находят применение в медицине. Использование фукоиданов как ингибиторов роста колоний в нетоксических дозах может оказаться перспективным для предотвращения и лечения раковых заболеваний.

Задачами нашей дальнейшей работы является исследование взаимосвязи между структурными особенностями фукоиданов и их противоопухолевым действием.

РФФИ № 09-04-00761-а, № 09-04-90312-Вьетнма и программы «Молекулярная клеточная биология».Работа выполнена при поддержке грантов