Перспективы использования Альгината Натрия в комплексной терапии злокачественных новообразований

О.Ю. Рыбалкина, К.А. Лопатина, Е.А. Сафонова, Л.А. Ефимова

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АЛЬГИНАТА НАТРИЯ
С РАЗЛИЧНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ
ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

Научно-исследовательский институт фармакологии им. Е.Д. Гольдберга (Томск)

Высокая заболеваемость и смертность от злокаче­ственных новообразований диктуют необходимость разработки новых, более эффективных, подходов к их лечению. Несмотря на то, что в последние десятиле­тия значительные усилия и ресурсы направляются на разработку новых таргетных препаратов, цитостати­ки по-прежнему остаются незаменимыми средствами химиотерапии опухолей, особенно на поздних стадиях болезни. Однако токсичность в отношении здоровых клеток организма и быстрое развитие химиорези­стентности опухоли в процессе лечения лимитируют использование цитостатиков. Таким образом, одним из подходов, направленных на совершенство­вание схем традиционной химиотерапии, является не только повышение эффективности, но и снижение ее побочного действия на различные системы организ­ма за счет использования препаратов-корректоров. При этом лекарственные средства, повышающие эффективность химиотерапии, отсутствуют. В каче­стве такого рода средств все больше получают пред­почтение препараты природного происхождения, в частности, растительного, в реализации эффектов которых важная роль принадлежит флавоноидам, алкалоидам, гликозидам, витаминам, дубильным веществам. Менее изученными в этом плане оста­ются полисахариды, ярким представителем которых является альгинат натрия. Между тем, они являются перспективными для создания на их основе пре­паратов дополнительной терапии злокачественных опухолей благодаря низкой токсичности, высокой биологической доступности и богатой сырьевой базе. Кроме того, в настоящее время класс полисахаридов привлекает к себе большой интерес из-за широкого спектра фармакологических свойств, обладая гастро­протекторной, пребиотической, иммуномодулиру­ющей, радиопротекторной, гиполипидемической и другими видами активности.

Цель работы: изучить влияние альгината на­трия с различной молекулярной массой на развитие перевиваемых опухолей животных в условиях цито­статической терапии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на 255 аутбредных мышах CD1 и 195 мышах линии C57ВL/6 обоего пола. Животные 1-й категории (конвенциональные мыши) разводки ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН (сертификат качества № 188-05) содержались в соответствии с между­народными правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [9]. Дизайн исследования одобрен Этическим комитетом ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН.

Трансплантацию аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) аутбредным мышам CD1 производили внутрибрю­шинно по 7,5 х 106 клеток в 0,2 мл физиологического раствора. Карциному легких Льюис (3LL) мышам линии C57BL/6 перевивали гомогенатом опухолевой ткани внутримышечно по 5-6 х 106 опухолевых клеток в объеме 0,1 мл физиологического раствора [6].

Циклофосфан (ЦФ) (ОАО «Биохимик», г. Саранск, Россия) вводили мышам однократно внутримышечно (АКЭ) в дозе 150 мг/кг через 72 часа после перевивки опухоли либо внутрибрюшинно (3LL) в дозе 125 мг/ кг (на 10-е сутки).

Образцы альгинатов натрия, полученные из бурой водоросли по оригинальной методике хи­мического гидролиза природных полисахаридов и стандартизованные по физико-химическим свой­ствам, были предоставлены для исследования лабо­раторией фармакологии Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН (г. Владивосток). Фи­зико-химические параметры исследуемых образцов альгината натрия с различной молекулярной массой представлены в таблице 1.

Полисахариды растворяли в дистиллированной воде и начинали вводить мышам внутрижелудочно в дозах 50 и 100 мг/кг через 24 часа после перевивки асцитной опухоли АКЭ и продолжали в течение 7 су­ток. Животных с 3LL начинали лечить полисахари­дами через 7 суток после перевивки и продолжали в течение 11-13 суток.

По окончании экспериментов животных умерщ­вляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», проводили вскрытие, ревизию внутренних органов, выделение опухоли и метастазов, производили забор асцитической жидкости. Определяли объем опухо­левых клеток, массу опухоли, процент торможения ее роста, частоту метастазирования, количество и площадь метастазов в легких, индекс ингибирования метастазирования [1, 6]. Для определения значимости различий использовали непараметрический крите­рий Вилкоксона - Манна - Уитни, точный тест Фише­ра. Различия считали достоверными при р < 0,05 [3].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдбер­га» СО РАМН в течение ряда лет ведется исследование биологически активных соединений из природных источников с целью создания на их основе препара­тов, повышающих эффективность специфических методов лечения больных со злокачественными новообразованиями, выработана общая стратегия их изучения. На моделях аденокарциномы Эрлиха и кар­циномы легких Льюис оценивается влияние веществ из растительного сырья на развитие опухолевого про­цесса и эффективность цитостатической терапии, из­учается возможность коррекции изменений в системе крови после воздействия противоопухолевого агента.

Выбор на первом этапе скрининга модели аде­нокарциномы Эрлиха обусловлен возможностью получения результатов в короткие сроки, а также чувствительностью этой опухоли к веществам при­родного происхождения.

При изучении влияния альгинатов натрия с раз­личной молекулярной массой на развитие АКЭ пока­зано отсутствие связи между молекулярной массой и противоопухолевым эффектом. Так, при изолирован­ном введении мышам CD1 как низкомолекулярных образцов альгината натрия (М = 1 kDa в дозе 50 мг/ кг, M = 1-10 kDa в дозах 50 и 100 мг/кг), так и высоко­молекулярного альгината натрия в дозе 100 мг/кг наблюдалось торможение роста опухоли (на 42 %, 36 %, 36 % и 45 % соответственно) (табл. 2). При изолиро­ванном введении альгината натрия (M = 20-30 kDa) в дозе 100 мг/кг не отмечено ингибирующего влияния на рост опухоли, а при совместном назначении с ЦФ выявлено повышение противоопухолевой активности последнего: торможение роста опухоли составило 39 % против 17 % в группе животных, получавших только цитостатик. В то же время введение в схему химиотерапии альгината натрия с молекулярной массой 403 kDa (50 мг/кг) способствовало стимуляции роста АКЭ у мышей (табл. 2).

По-видимому, в фармакологических эффектах этих веществ имеет значение не только их молекулярная масса, но и химическая структура. Подтверждают сказанное сведения о том, что противоопухолевая активность альгинатов зависит от соотношения маннуроновых и гулуроновых кислот. Так, альгинаты с большим количеством p-D-маннуроновой кислоты обладают иммуномодулирующим действием и более выраженным противоопухолевым эффектом, чем содержащие a-L-гулуроновую кислоту [8].

Второй этап исследования проведен на мышах с 3LL и посвящен оценке влияния исследуемых соеди­нений на развитие первичной опухоли и метастазов. 3LL характеризуется высокой интенсивностью диссе- минации опухоли и дает макроскопические метастазы, доступные для качественного и количественного ана­лиза простыми способами. Считается, что карцинома легких Льюис по чувствительности к цитостатикам аналогична солидным опухолям человека.

 

Физико-химические параметры исследуемых образцов альгината натрия с различной молекулярной массой

Таблица № 1

Параметры

Образец

Альгинат натрия (M = 403 kDa)

Альгинат натрия (M = 20-30 kDa)

Альгинат натрия (M = 1-10 kDa)

Альгинат натрия (M = 1 kDa)

Содержание натрия (%)

8,5

9,5-11,0

9,5-11,0

9,5-11,0

Содержание уроновых кислот (%)

77,3

85,2

85,2

85,2

Содержание золы (%)

28,0-31,0

28,0-31,0

0

0

Влажность (%)

< 8,0

 

Влияние альгинатанатрия с различной молекулярной массой на развитие АКЭ и эффективность терапии циклофосфаном аутбредных мышей CD1

Таблица № 2

Группа наблюдения, доза препарата

Объем опухолевых клеток (Х ± m), мл

Торможение роста опухоли, %

Серия 1. Альгинат натрия (М = 403 kDa) - образец 1

1. Контроль

1,83 ± 0,17

-

2. Образец 1,50 мг/кг

1,97 ± 0,04

-8

3. Образец 1, 100 мг/кг

1,01 ± 0,22*

45

4. ЦФ

1,40 ± 0,22

23

5. ЦФ + образец 1,50 мг/кг

1,85 ± 0,14##

-1

6. ЦФ + образец 1, 100 мг/кг

1,64 ± 0,11

10

Серия 2. Альгинат натрия (М = 20-30 kDa) - образец 2

1. Контроль

1,78 ± 0,18

-

2. Образец 2, 50 мг/кг

2,13 ± 0,11

-20

3. Образец 2, 100 мг/кг

1,75 ± 0,08

2

4. ЦФ

1,47 ± 0,13

17

5. ЦФ + образец 2, 50 мг/кг

1,26 ± 0,11*

29

6. ЦФ + образец 2, 100 мг/кг

1,08 ± 0,07**

39

Серия 3. Альгинат натрия (М = 1-10 kDa) - образец 3

1. Контроль

1,69 ± 0,13

-

2. Образец 3, 50 мг/кг

1,08 ± 0,11*

36

3. Образец 3, 100 мг/кг

1,08 ± 0,13*

36

4. ЦФ

0,75 ± 0,11*

56

5. ЦФ + образец 3, 50 мг/кг

0,56 ± 0,11

67

6. ЦФ + образец 3, 100 мг/кг

0,93 ± 0,12

45

Серия 4. Альгинат натрия (М = 1 kDa) - образец 4

1. Контроль

1,92 ± 0,14

-

2. Образец 4, 50 мг/кг

1,12 ± 0,13*

42

3. Образец 4, 100 мг/кг

1,51 ± 0,22

21

4. ЦФ

0,84 ± 0,12*

56

5. ЦФ + образец 4, 50 мг/кг

0,57 ± 0,06

70

6. ЦФ + образец 4, 100 мг/кг

0,66 ± 0,06

66

 

Анализ результатов экспериментов позволил разделить исследуемые полисахариды по характеру влияния на опухолевый процесс изолированно и в схеме химиотерапии на три группы: 1) умеренно тормозящие развитие первичной опухоли; 2) ока­зывающие ингибирующее влияние на процесс мета- стазирования; 3) усиливающие антиметастатическое действие цитостатика (таблица 3).

В первую группу вошел альгинат натрия с вы­сокой молекулярной массой. Применение этого по­лисахарида в изолированном режиме введения для лечения мышей с 3LL привело к статистически зна­чимому торможению роста первичного опухолевого узла (таблица 3).

Во вторую группу вошли низкомолекулярные полисахариды, оказавшие ингибирующее влияние на процесс метастазирования карциномы лёгких Льюис при изолированном применении. Так, при лечении мышей альгинатом натрия с молекулярной массой 1 kDa, 1-10 kDa и 20-30 kDa снижалось количество гематогенных метастазов в легких (в 1,2; 1,1 и 1,3; 1,4 раза соответственно), по сравнению с аналогичным показателем у нелеченых животных. Кроме того, при использовании альгината натрия (М = 1 kDa) в дозе 100 мг/кг, альгината натрия (M = 1-10 kDa) в обеих дозах уменьшилось не только количество метастазов в легких, но и их площадь (табл. 3).

В третью группу полисахаридов, повышающих противометастатический эффект циклофосфана, вошли альгинатынатрия как с низкой, так и с высо­кой молекулярной массой. Так, при использовании альгината натрия с молекулярной массой 20-30 kDa и 403 kDa с циклофосфаном для лечения мышей с 3LL уменьшилось как количество метастазов в легких, так и их площадь, по сравнению с этими показателями у получавших цитостатик животных (табл. 3).

 

Влияние альгината натрия с различной молекулярной массой на развитие 3LL и эффективность терапии циклофосфаном у мышей-самок линии С57ВL/6

Таблица № 3

Группа наблюдений, доза препарата

Масса опухоли (Х ± m), г

ТРО, %

ЧМ, %

Количество метастазов на 1 мышь (Х ± m)

Площадь метастазов на 1 мышь (X ± m), мм2

ИИМ, %

Серия 1. Альгинат натрия (М = 403 kDa) - образец 1

1. Контроль

7,09 ± 0,28

-

100

27,80 ± 2,01

60,84 ± 19,51

-

2. Образец 1,50 мг/кг

6,23 ± 0,28*

12

100

27,80 ± 2,58

67,28 ± 21,64

0

3. Образец 1, 100 мг/кг

6,47 ± 0,35

9

100

23,90 ± 2,08

45,68 ± 7,56

14

4. ЦФ

4,97 ± 0,22*

30

80*

6,40 ± 1,85*

1,67 ± 0,68*

82

5. ЦФ + образец 1,50 мг/кг

4,15 ± 0,29

41

60

1,60 ± 0,69**

0,67 ± 0,58**

97

6. ЦФ + образец 1, 100 мг/кг

4,65 ± 0,47

34

70

3,90 ± 2,28

1,19 ± 0,77

90

Серия 2. Альгинат натрия (М = 20-30 kDa) - образец 2

1. Контроль

7,09 ± 0,28

-

100

27,80 ± 2,01

60,84 ± 19,51

-

2. Образец 2, 50 мг/кг

7,29 ± 0,22

-3

100

26,70 ± 2,64

49,85 ± 11,03

4

3. Образец 2, 100 мг/кг

7,15 ± 0,20

-0,8

100

19,80 ± 2,33*

26,60 ± 3,56

29

4. ЦФ

4,97 ± 0,22*

30

80*

6,40 ± 1,85*

1,67 ± 0,68*

82

5. ЦФ + образец 2, 50 мг/кг

4,75 ± 0,32

33

90

3,50 ± 0,97

1,32 ± 0,65

89

6. ЦФ + образец 2, 100 мг/кг

5,17 ± 0,29

27

70

1,60 ± 0,43**

0,11 ± 0,03**

96

Серия 3. Альгинат натрия (М = 1-10 kDa) - образец 3

1. Контроль

6,59 ± 0,11

-

100

32,00 ± 1,60

77,44 ± 11,03

-

2. Образец 3, 50 мг/кг

6,09 ± 0,30

8

100

28,63 ± 1,20*

30,05 ± 3,92*

10

3. Образец 3, 100 мг/кг

6,61 ± 0,25

-0,3

100

24,60 ± 2,10*

37,07 ± 7,39*

23

4. ЦФ

5,20 ± 0,18*

21

50*

3,70 ± 1,57*

1,40 ± 0,73*

94

5. ЦФ + образец 3, 50 мг/кг

5,20 ± 0,15

21

70

2,40 ± 0,99

1,55 ± 0,98

95

6. ЦФ + образец 3, 100 мг/кг

5,53 ± 0,26

16

60

1,30 ± 0,50

0,45 ± 0,25

98

Серия 4. Альгинат натрия (М = 1 kDa) - образец 4

1. Контроль

6,59 ± 0,11

-

100

32,00 ± 1,60

77,44 ± 11,03

-

2. Образец 4, 50 мг/кг

6,92 ± 0,19

-5

100

34,56 ± 4,41

50,76 ± 11,79

-8

3. Образец 4, 100 мг/кг

6,75 ± 0,27

-2

100

26,50 ± 3,39*

49,42 ± 7,99*

17

4. ЦФ

5,20 ± 0,18*

21

50*

3,70 ± 1,57*

1,40 ± 0,73*

94

5. ЦФ + образец 4, 50 мг/кг

5,19 ± 0,08

21

70

2,20 ± 0,80

0,72 ± 0,44

95

6. ЦФ + образец 4, 100 мг/кг

4,98 ± 0,21

24

80

4,00 ± 1,28

2,02 ± 0,85

90

 

В механизме противоопухолевого действия по­лисахаридов одним из ключевых звеньев является их способность оказывать влияние на апоптоз опухоле­вых клеток. Другой возможный механизм, приво­дящий к торможению роста опухоли под влиянием рас­тительных полисахаридов, может быть опосредован активацией системы естественной резистентности, способствующей элиминации из организма трансфор­мированных клеток. Установлено, что альгинаты об­ладают иммуномодулирующей активностью, в частно­сти, они активируют антиген-презентирующие клетки (макрофаги, дендритные клетки, В-лимфоциты), стимулируют Т-лимфоциты, индуцируют продукцию IFN-y и ИЛ-2. Антиметастатическое действие поли­сахаридов, помимо активации иммунной системы ор­ганизма, может быть связано с уменьшением процесса ангиогенеза в опухолевой ткани (неоангиогенеза), который способствует развитию метастазов на этапах инвазии и миграции опухолевых клеток. В литературе встречаются данные, свидетельствующие о наличии у полисахаридов антиангиогенных свойств.

Таким образом, анализ результатов скринингово­го исследования альгината натрия с различной моле­кулярной массой позволил определить наиболее пер­спективным для дальнейшего исследования альгинат натрия с молекулярной массой 20-30 kDa, который повышал эффективность химиотерапии мышей как с аденокарциномой Эрлиха, так и с карциномой легких Льюис. Необходимо отметить тот факт, что этот об­разец полисахаридов, помимо описанных эффектов, также обладает гемостимулирующей активностью, снижая токсическое действие химиотерапии на кро­ветворную ткань.